摘要：本研究聚焦颠茄发根，详述外源基因表达系统构建过程。涵盖发根诱导、载体构建、转化优化、表达检测等环节。通过创新方法精准调控，旨在为颠茄药用成分改良、基因功能探究提供技术支撑，推动颠茄生物技术应用发展。
一、引言
（1）颠茄的药用价值与研究需求颠茄作为重要药用植物，富含莨菪碱、东莨菪碱等生物碱，在镇痛、麻醉、抗胆碱等医药领域应用广泛。然而，野生与传统栽培颠茄中有效成分含量不稳定、提取难度大。借助基因工程构建外源基因表达系统，有望定向提升其药用品质，满足临床需求。（2）发根培养优势及应用前景发根具有生长迅速、遗传稳定、激素自养等特性，是理想的基因工程受体。在颠茄研究中，发根培养可实现药用成分工厂化生产，同时为外源基因功能验证提供天然 “实验室”，开启颠茄精准育种、高效制药新篇章。
二、材料与方法
（1）实验材料选取健壮颠茄植株，采集幼嫩叶片、茎段作为外植体源。储备 MS 培养基及其改良配方，准备发根农杆菌菌株（如 A4、R1000 等），构建含目标基因的植物表达载体，配备 PCR 扩增、电泳检测等分子生物学试剂。（2）发根诱导实验外植体预处理：将采集外植体用洗洁精水轻柔清洗 15 分钟，去除表面杂质，于超净台内 75% 酒精浸泡 30 秒，0.1% 升汞振荡消毒 8 - 10 分钟，无菌水冲洗 5 - 7 次。侵染条件摸索：调整发根农杆菌菌液 OD600 至 0.5 - 0.8，添加 100 - 200μM 乙酰丁香酮，对外植体侵染 10 - 15 分钟，25℃暗培养 2 - 3 天，转至除菌培养基，观察发根诱导情况。（3）表达载体构建与转化实验载体构建策略：依据目标基因特性，选择合适启动子（如 CaMV 35S、ubi 等）、终止子，利用限制性内切酶、DNA 连接酶构建重组质粒，转化大肠杆菌筛选阳性克隆，测序验证序列准确性。转化发根方法：采用冻融法将重组质粒导入发根农杆菌感受态细胞，经抗性筛选获得工程菌。再用工程菌侵染预培养外植体，优化共培养、恢复培养条件促进转化。（4）外源基因表达检测实验分子水平鉴定：对转化发根提取基因组 DNA，PCR 扩增目标基因片段，电泳判断是否整合；进一步用 Northern blot 检测转录水平，明确基因表达起始。生化水平分析：通过高效液相色谱（HPLC）测定发根中目标蛋白或次生代谢产物含量，关联基因表达与产物积累，评估表达系统效能。
三、结果与分析
（1）发根诱导结果经优化，在菌液 OD600 = 0.6、添加 150μM 乙酰丁香酮时，颠茄幼叶外植体发根诱导率达 70%，诱导出的发根粗壮、分支多，7 天左右可见明显生长，污染率低于 8%，为后续转化奠基。（2）表达载体构建与转化结果成功构建含目标基因的高效表达载体，转化发根农杆菌后工程菌阳性率超 85%。侵染外植体后，转化发根经抗性筛选稳定生长，PCR 检测证实基因整合，部分转化发根呈现表型变化，预示基因功能表达。（3）外源基因表达检测结果分子检测显示转化发根目标基因转录活跃，Northern blot 有条带清晰显现；HPLC 分析表明，携带特定基因的发根中，目标次生代谢产物含量较野生型提升 30% - 50%，基因表达系统初显成效。
四、讨论
（1）发根诱导关键因素探讨外植体年龄、农杆菌菌株活力及侵染参数是诱导。幼嫩外植体易响应，合适菌液浓度与侵染时长平衡转化与损伤，乙酰丁香酮增强 Vir 基因介导的 T - DNA 转移，协同优化发根起始。（2）表达载体优化策略启动子强度、载体拷贝数调控基因表达丰度。强启动子驱动高效转录，多拷贝载体增加模板量，但需防基因沉默。精准设计载体架构，适配颠茄基因表达需求，保障外源基因长效稳定。（3）研究应用拓展方向本研究为颠茄基因编辑、多基因共表达开拓路径，有望培育高药效新品种。在制药产业，发根生物反应器可低成本量产药用成分，推动天然药物现代化进程，多领域联动赋能颠茄发展。
五、结论
本研究成功构建颠茄发根中外源基因表达系统，明晰发根诱导、载体转化、表达检测关键环节。确立参数组合，实现外源基因高效表达，为颠茄药用开发、基因工程应用筑牢根基，后续持续深化研究，挖掘颠茄更多潜能。