摘要

本文研究了基于定向改造的酿酒酵母丙酮酸积累，通过基因敲除和发酵条件优化，显著提高了酿酒酵母中丙酮酸的积累量。实验结果显示，优化后的酿酒酵母菌株丙酮酸积累量提高了168%，为丙酮酸的工业化生产提供了新的策略。

引言

丙酮酸是生物细胞内糖酵解途径（EMP）中的关键中间产物，不仅在生物能量代谢中具有重要作用，而且是多种有用物质的前体，广泛应用于化工、农药、农用化学品及生物制药等领域。目前，丙酮酸的生产主要依赖于微生物发酵，其中光滑球拟酵母（Torulopsis glabrata）是常用的生产菌株。然而，光滑球拟酵母是一种条件致病菌，存在潜在的安全威胁。相比之下，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为一种公认的安全菌，在食品工业和酒精生产中有着广泛应用，因此更适合作为丙酮酸的生产菌株。

酿酒酵母中的丙酮酸主要通过糖酵解途径生成，并随后进入乙醇发酵途径被转化为乙醇和二氧化碳。为了提高酿酒酵母中丙酮酸的积累量，需要阻断乙醇生成途径，使代谢流更多地流向丙酮酸。丙酮酸脱羧酶（PDC）是催化丙酮酸转化为乙醛的关键酶，通过敲除PDC基因，可以阻断乙醇生成途径，从而提高丙酮酸的积累量。

本研究旨在通过定向改造酿酒酵母，敲除PDC基因，并通过发酵条件优化，提高丙酮酸的积累量。这不仅有助于解决光滑球拟酵母的安全性问题，还能为丙酮酸的工业化生产提供新的策略。

材料与方法

1. 实验材料

  • 菌株：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Y2

  • 试剂：某试剂G418、某试剂醋酸锂、某试剂PCR试剂、某试剂Southern blot试剂、某试剂葡萄糖、某试剂蛋白胨、某试剂酵母粉、某试剂KH2PO4、某试剂MgSO4·7H2O、某试剂醋酸钠、某试剂玉米浆

  • 仪器：威尼德电穿孔转化仪、某品牌PCR仪、某品牌凝胶成像系统、某品牌摇床、某品牌发酵罐

2. 实验方法
2.1 基因敲除

  1. pdcl基因敲除：设计pdcl基因的敲除片段（P1K），通过电穿孔转化法将敲除片段转化到酿酒酵母S. cerevisiae Y2中，在含G418抗性的YEPD平板上筛选转化子。通过PCR和Southern blot验证得到pdcl基因的敲除菌株S. cerevisiae Y2-1。

  2. pdc5基因敲除：设计pdc5基因的敲除片段（P5H），通过醋酸锂转化法将敲除片段转化到S. cerevisiae Y2-1中，在YNBG平板上筛选转化子。通过PCR和Southern blot验证得到pdcl和pdc5基因都缺失的菌株S. cerevisiae Y2-15。

2.2 发酵条件优化

  1. 种子培养基：葡萄糖30g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，醋酸钠2g/L，玉米浆0.5%，pH 5.6。

  2. 发酵培养基：葡萄糖80g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，醋酸钠2.5g/L，玉米浆1%，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，金属离子母液5mL，pH 5.6。

  3. 发酵条件：种龄26h，接种量12%，装液量70mL/250mL三角瓶。

2.3 丙酮酸测定

采用高效液相色谱法测定发酵液中丙酮酸的浓度。

实验结果

1. 基因敲除结果

通过PCR和Southern blot验证，成功得到了pdcl基因敲除菌株S. cerevisiae Y2-1和pdcl、pdc5基因都缺失的菌株S. cerevisiae Y2-15。

2. 发酵条件优化结果

优化后的发酵条件下，S. cerevisiae Y2-15的丙酮酸积累量显著提高。与优化前相比，丙酮酸的积累量从9.25g/L提高到24.85g/L，提高了168%。

讨论

1. 基因敲除对丙酮酸积累的影响

PDC基因是酿酒酵母中催化丙酮酸转化为乙醛的关键酶基因。通过敲除PDC基因，阻断了乙醇生成途径，使代谢流更多地流向丙酮酸。本研究中，首先敲除了pdcl基因，得到S. cerevisiae Y2-1菌株，在此基础上进一步敲除了pdc5基因，得到S. cerevisiae Y2-15菌株。实验结果显示，敲除两个PDC基因后，丙酮酸的积累量显著提高，说明基因敲除策略是有效的。

2. 发酵条件优化对丙酮酸积累的影响

发酵条件对微生物代谢产物的积累具有重要影响。本研究通过优化种子培养基、发酵培养基和发酵条件，显著提高了S. cerevisiae Y2-15菌株的丙酮酸积累量。优化后的种子培养基和发酵培养基提供了适宜的营养物质比例和浓度，有利于菌体的生长和代谢产物的积累。优化后的发酵条件，如种龄、接种量和装液量，有利于氧气的传递和菌体的代谢活动，从而提高了丙酮酸的积累量。

3. 研究的创新与应用前景

本研究通过定向改造酿酒酵母，敲除PDC基因，并通过发酵条件优化，显著提高了丙酮酸的积累量。这种策略不仅解决了光滑球拟酵母的安全性问题，还为丙酮酸的工业化生产提供了新的思路。酿酒酵母作为一种公认的安全菌，在食品工业和酒精生产中有着广泛应用，因此，改造后的酿酒酵母菌株具有广阔的应用前景。此外，本研究中的基因敲除和发酵条件优化策略也可以为其他微生物代谢产物的生产提供借鉴。

丙酮酸作为一种重要的有机酸，在化工、农药、农用化学品及生物制药等领域有着广泛的应用。随着生物技术的不断发展，微生物发酵法生产丙酮酸将成为未来的主要趋势。本研究通过定向改造酿酒酵母，提高了丙酮酸的积累量，为丙酮酸的工业化生产提供了新的策略，具有重要的理论和实践意义。

结论

本研究通过定向改造酿酒酵母，敲除PDC基因，并通过发酵条件优化，显著提高了丙酮酸的积累量。实验结果显示，优化后的酿酒酵母菌株丙酮酸积累量提高了168%。这种策略不仅解决了光滑球拟酵母的安全性问题，还为丙酮酸的工业化生产提供了新的思路。改造后的酿酒酵母菌株具有广阔的应用前景，为丙酮酸的生产和应用提供了新的策略。本研究为其他微生物代谢产物的生产提供了借鉴，具有重要的理论和实践意义。

通过上述研究，我们不仅提高了酿酒酵母中丙酮酸的积累量，还为丙酮酸的工业化生产提供了新的策略。未来，我们将继续深入研究酿酒酵母的代谢调控机制，进一步优化发酵条件，提高丙酮酸的产量和质量，为丙酮酸的应用提供更广阔的空间。