摘要

本文介绍了一种阳性转染细胞亲和分选方法及试剂盒，该方法通过构建一种基于细胞膜表面定位荧光蛋白标签的亲和分选系统，实现了对转染阳性细胞的高效分选。实验结果表明，该系统具有操作简便、细胞损伤小、适用性广等优点，为基因功能研究提供了有力工具。

引言

细胞转染技术是现代分子生物学研究中的一种重要技术手段，它可以将外源DNA、RNA或其他生物大分子导入细胞内，从而实现对细胞功能的研究和调控。然而，在难转染细胞中，如淋巴瘤/白血病细胞以及原代细胞，转染效率往往较低，这限制了这些细胞为基础的功能研究。因此，如何在难转染细胞中进一步提高阳性率成为关键问题。

目前，提高阳性细胞比例的策略主要包括抗生素药物筛选、流式细胞荧光分选（FACS）和磁性细胞分选（MACS）等方法。然而，这些方法存在操作复杂、实验周期长、仪器昂贵、细胞损伤大等局限性。因此，开发一种操作快速、简单，成本低，适用性广，并且对细胞干扰较小的富集转染阳性细胞的方法显得尤为重要。

本研究旨在构建一种基于磁珠亲和分选的细胞分离系统，实现快速、高效的富集转染阳性细胞。通过构建一种可高效分选转染阳性细胞的亲和分选系统，在表达载体上编码融合了膜定位信号、亲和标签标记的荧光蛋白，荧光蛋白和膜定位信号在转染阳性的细胞融合表达，从而实现对转染阳性细胞的高效分选。

材料与方法

材料

  1. 细胞株：Lenti-X293T细胞、前列腺癌细胞22Rv1、白血病细胞K-562及Jurkat细胞。

  2. 表达载体：包含膜定位信号、荧光蛋白及亲和分选标签的编码序列的质粒载体，如pEGFP-C2。

  3. 磁珠：Magrose Strep-Tactin磁珠。

  4. 试剂：某品牌脂质体转染试剂、某品牌DPBS溶液、某品牌BSA。

  5. 仪器：某品牌流式细胞仪、某品牌激光共聚焦荧光显微镜。

方法

  1. 细胞培养：将Lenti-X293T细胞、前列腺癌细胞22Rv1、白血病细胞K-562及Jurkat细胞在相应的培养基中培养至对数生长期。

  2. 基因构建：通过PCR扩增目的基因，并克隆至载体pEGFP-C2中，构建包含膜定位信号、亲和分选标签及荧光蛋白的表达框。具体步骤如下：

    • 使用SignalP-5.0 Server在线分析获取膜定位信号的编码序列以及信号肽剪切位点。

    • 通过多重PCR将膜定位信号、亲和分选标签及荧光蛋白的编码序列融合，并通过AgeI/BglII酶切连接的方式克隆到pEGFP-C2载体中。

  3. 转染：采用某品牌脂质体转染试剂将构建好的质粒载体导入细胞中。

  4. 亲和分选：

    • 将转染后的细胞与Magrose Strep-Tactin磁珠孵育，使磁珠与细胞表面的亲和标签结合。

    • 通过外加磁场或自然沉降方式固定磁珠-细胞复合物。

    • 使用温和的洗脱缓冲液（含有0.05~0.15%BSA的DPBS溶液）将结合的细胞从磁珠上释放出来，实现阳性细胞的亲和分选。

  5. 检测与定量：

    • 使用某品牌流式细胞仪检测分选前后细胞的阳性率。

    • 通过激光共聚焦荧光显微镜观察不同分选标签在细胞膜外层的定位情况。

实验结果

  1. 分选标签的细胞膜定位：将六种不同分选标签的质粒分别转染Lenti-X293T细胞，通过激光共聚焦荧光显微镜观察发现，六种基于TST-EGFP的分选标签分子都可以高水平的表达并且有效的定位到细胞膜上。其中，三种GPI膜锚定类型的分选标签不仅具有良好的膜定位效果，并且细胞拥有正常的形态。

  2. 转染阳性细胞的亲和分选：将六种分选标签质粒转染到三种细胞中，包括悬浮生长的白血病细胞K-562，贴壁生长的Lenti-X293T细胞和前列腺癌细胞22Rv1，使用Strep-Tactin磁珠分选阳性细胞并通过流式细胞术测定不同变体对阳性细胞的分选效率。结果表明，六种分选标签在不同细胞系中均表现出了有效的富集转染阳性细胞的能力。尤其是基于GPI膜锚定的三种分选标签（TST-EGFP-GPI BY55，TST-EGFP-GPI DAF，TST-EGFP-GPI CEAM7），其富集阳性细胞的能力显著高于基于跨膜结构域的分选标签。

  3. 难转染细胞的分选效果：在难转染的Jurkat白血病细胞中对三种基于GPI膜锚定分选标签进行了转染阳性细胞分选实验。结果表明，这三种分选标签也表现出了高效的阳性细胞分离能力。经过分选，TST-EGFP-GPI BY55，TST-EGFP-GPI DAF，和TST-EGFP-GPI CEAM7三种分选标签可将阳性细胞比例从13%分别提高到67%，77%和63%。

  4. 分选效率的优化：通过自然沉降的方式而不是依赖外部磁场的作用分离结合了细胞的磁珠，发现在K-562细胞中经过TST-EGFP-GPI BY55分选标签富集之后，转染阳性细胞的比例达到95%以上。

讨论

本研究构建了一种基于磁珠亲和分选的细胞分离系统，实现了对转染阳性细胞的高效分选。该系统通过在表达载体上编码融合了膜定位信号、亲和标签标记的荧光蛋白，使荧光蛋白和膜定位信号在转染阳性的细胞融合表达。基于该亲和分选系统，膜定位信号将荧光蛋白定位到细胞膜外表面，确保了技术人员可以直观的通过流式细胞仪或者荧光显微镜来评估转染阳性细胞比例。

亲和标签的使用让技术人员可以通过磁珠分选的方式来快速高效的分离转染阳性细胞。在本研究中，Twin-Strep-tag（TST）作为一种理想的亲和标签短肽，与Strep-Tactin蛋白具有更高的亲和力，被融合到绿色荧光蛋白分子的N端，作为亲和分选标签分子。实验结果表明，基于GPI膜锚定的分选标签具有更高的富集阳性细胞的能力。

此外，该系统的优势在于操作简便、细胞损伤小、适用性广。与现有的流式细胞荧光分选（FACS）和磁性细胞分选（MACS）等方法相比，该系统不需要昂贵的实验仪器，实验成本低，且操作简便。通过调整磁珠的使用量即可在同一时间和批次处理不同数量级的细胞样品，省时省力，且通量几乎不受限制。

在难转染细胞中，该系统也表现出了高效的阳性细胞分离能力。这对于以难转染细胞为基础的功能研究具有重要意义。通过该系统，可以实现对难转染细胞中基因递送效率的显著提高，为后续的基因功能研究提供了有力工具。

研究的创新与应用前景

本研究的创新之处在于构建了一种基于细胞膜表面定位荧光蛋白标签的亲和分选系统，实现了对转染阳性细胞的高效分选。该系统具有操作简便、细胞损伤小、适用性广等优点，为基因功能研究提供了有力工具。

在应用前景方面，该系统可以广泛应用于各种类型的实验研究，包括基因过表达分析、基因敲降分析、基因分析、基因编辑分析以及相关的细胞功能研究实验等。通过将分选标签的表达框插入到其他类型的载体上，即可将该转染阳性细胞的分选方法应用于不同类型的实验研究。

此外，该系统还可以与其他技术相结合，如基因组编辑技术（如CRISPR/Cas9）、高通量测序技术等，进一步拓展其在基因功能研究中的应用范围。

结论

本研究成功构建了一种基于磁珠亲和分选的细胞分离系统，实现了对转染阳性细胞的高效分选。该系统通过在表达载体上编码融合了膜定位信号、亲和标签标记的荧光蛋白，使荧光蛋白和膜定位信号在转染阳性的细胞融合表达。实验结果表明，该系统具有操作简便、细胞损伤小、适用性广等优点，为基因功能研究提供了有力工具。

在未来的研究中，将进一步优化该系统，提高其分选效率和稳定性。同时，将探索该系统在更多类型细胞中的应用，以及与其他技术相结合的可能性，为基因功能研究提供更加全面和深入的工具和方法。