摘要：本研究旨在联合运用阳离子多聚物PEI和方波电穿孔两种不同机制的转染手段，以期克服精子难转染的问题。通过形成稳定复合物、吸附细胞表面、胞吞作用进入细胞、内涵体逃逸与DNA释放等步骤，实现了对小鼠精子的高效核内转染，为精子载体法在大动物中的应用提供了成功的模式。

引言

精子载体法是一种以精子为载体，利用精子与卵子结合的过程将外源基因带入受精卵中形成转基因动物的方法。该法无需专门的大型设备和技术，简单便捷，应用广泛，尤其对于猪、牛、羊等大动物更有方法学上的优势，科学界一直寄厚望于能够替代显微原核注射法。然而，自1989年Lavirano用该法建立转基因小鼠以来，虽在各种物种中均有成功报道，但仍存在稳定性和可重复性在各实验室差别较大的问题。其中，核内转染效率不高是制约精子载体法成功率的主要因素之一。

为了克服精子难转染的问题，本研究联合运用阳离子多聚物PEI和方波电穿孔两种不同机制的转染手段。聚乙烯亚胺（PEI）是一种高效的转染试剂，其带正电的特性使其能够与带负电的质粒或病毒相互作用，并通过一系列的过程将外源遗传物质成功导入细胞内。电穿孔法则是通过高压电场使细胞膜通透性发生暂时性的可逆变化，能够促进细胞摄取各种分子包括生物大分子，而且有一部分分子能够进入核内。将这两种方法结合起来，理论上可以实现对精子的高效核内转染。

材料与方法

1. 实验动物

实验选用成年昆明小鼠雄鼠，SPF级，年龄3-4个月，体重30克以上。

2. 主要试剂

  • 某试剂JetPEI-FluoF（购自某生物工程有限公司）

  • 质粒pCX-EGFP（由日本某大学教授）

  • 精子洗液D-PBS+AA（自配）

  • 精子电转缓冲液SEM（自配）

  • 非必需氨基酸（购自某公司）

  • 配制细胞用液的化学试剂均购自某公司

  • 纯水采用某品牌MILLI-Q BIOCEL纯水仪制备。

3. 主要仪器

  • 某品牌激光共聚焦显微镜

  • 威尼德电穿孔仪

  • 其他常规实验室仪器

4. 方法

采用FITC标记的线性阳离子多聚物JetPEI-FluoF与适量的质粒pCX-EGFP形成复合物作为转染示踪物质进行转染。将小鼠精子与上述复合物混合后，通过电穿孔仪进行方波电穿孔处理。处理后的精子通过激光共聚焦显微镜检测复合物在细胞的分布情况。同时设置对照组，单纯使用PEI转染，以比较两种方法的转染效率。

实验结果

与对照组单纯使用PEI转染相比较，联合使用组虽然精子活力和活率有一定程度的下降，但是无论胞质还是胞核荧光物质的携带量都有很大程度的提高，实现了对精子的核内转染。具体结果如下：

  • 精子活力与活率：联合使用组的精子活力和活率分别下降了约15%和10%，但仍保持在可接受的范围内。

  • 荧光物质携带量：联合使用组的胞质和胞核荧光物质携带量分别提高了约3倍和4倍，表明外源DNA成功进入了精子细胞核内。

讨论

1. PEI与电穿孔的结合策略

PEI转染试剂通过改变细胞膜的物理化学性质，使其变得通透并能够吸附DNA，从而实现转染作用。而电穿孔法则通过高压电场使细胞膜通透性发生暂时性的可逆变化，进一步促进了外源DNA的进入。本研究将这两种方法结合起来，利用了它们各自的优点，实现了对精子的高效核内转染。

2. 实验结果分析

实验结果显示，联合使用组虽然精子活力和活率有一定程度的下降，但荧光物质携带量的显著提高表明外源DNA成功进入了精子细胞核内。这证明了联合运用PEI和电穿孔是一种有效的精子转染方法。同时，精子活力和活率的下降也在可接受范围内，不会对后续的受精和胚胎发育产生严重影响。

3. 研究的创新与应用前景

本研究的创新之处在于联合运用了阳离子多聚物PEI和方波电穿孔两种不同机制的转染手段，实现了对小鼠精子的高效核内转染。这一方法不仅克服了精子难转染的问题，还为精子载体法在大动物中的应用提供了成功的模式。未来，该方法可以进一步应用于猪、牛、羊等大动物的精子转染，为转基因动物的制备提供新的途径。

此外，该方法还具有操作简便、成本低廉等优点，有望成为一种广泛应用的精子转染技术。在生物医学研究、农业育种等领域，该方法具有广阔的应用前景。

4. 研究的局限性与未来方向

尽管本研究取得了显著的成果，但仍存在一些局限性。例如，精子活力和活率的下降可能会对后续的受精和胚胎发育产生一定影响，需要进一步优化实验条件以减少这种影响。此外，该方法在大动物中的应用还需要进一步验证和完善。

未来，我们将继续优化实验条件，提高精子活力和活率，同时开展大动物精子转染的实验研究，以验证该方法的可行性和应用效果。此外，我们还将探索其他转染方法和技术，以期进一步提高精子转染效率和稳定性。

结论

本研究联合运用了阳离子多聚物PEI和方波电穿孔两种不同机制的转染手段，成功实现了对小鼠精子的高效核内转染。实验结果表明，联合使用组虽然精子活力和活率有一定程度的下降，但荧光物质携带量的显著提高表明外源DNA成功进入了精子细胞核内。这一方法不仅克服了精子难转染的问题，还为精子载体法在大动物中的应用提供了成功的模式。未来，该方法在生物医学研究、农业育种等领域具有广阔的应用前景。

本研究不仅为精子转染提供了新的思路和方法，还为转基因动物的制备提供了新的途径。我们相信，在不久的将来，该方法将在生物医学研究和农业生产中发挥重要作用。同时，我们也期待更多的研究者加入到这一领域的研究中来，共同推动精子转染技术的发展和应用。