摘要

本研究旨在探讨外源性端粒酶基因（hTERT）转染对猪气管上皮细胞（STECs）增殖特性的影响。通过脂质体法将重组质粒pCI-neo-hTERT导入STECs，转染后的细胞表现出增高的增殖活性，并保持基本的细胞生物学特征，为建立稳定传代的细胞系提供了可能。

引言

哺乳动物的气管黏膜上皮细胞（Trachea epithelium cells, TECs）不仅是多种病原体的靶细胞，也是阻挡病原入侵的重要屏障。猪气管上皮细胞（Swine trachea epithelium cells, STECs）作为研究猪呼吸道疾病发病机制的重要模型，其体外培养技术的建立具有重要意义。然而，原代培养的STECs存在寿命短暂的局限性，限制了其广泛应用。端粒酶是一种能够维持端粒长度的核糖核蛋白复合物，通过激活端粒酶，可以延长细胞在体外培养的寿命，从而实现细胞的永生化。本研究通过转染外源性端粒酶基因（hTERT）至STECs，探讨其对细胞增殖特性的影响，旨在为建立永生化的猪气管上皮细胞系奠定基础。

材料与方法

材料

  • 细胞：初生仔猪气管黏膜上皮细胞（STECs）

  • 质粒：重组质粒pCI-neo-hTERT

  • 试剂：某品牌链酶蛋白酶、某品牌脂质体转染试剂、某品牌G418抗生素、某品牌RNA提取试剂、某品牌PCR扩增试剂、某品牌Western blot试剂

  • 仪器：倒置显微镜、某品牌PCR仪、某品牌电泳仪、某品牌Western blot成像系统、威尼德电穿孔仪

方法

  1. STECs的分离与培养：无菌采取初生仔猪气管，采用链酶蛋白酶灌注冷消化法分离得到原代STECs。分离后的细胞在37℃、5% CO2条件下培养，并观察细胞形态。

  2. 细胞鉴定：采用间接免疫荧光法鉴定8型角蛋白的上皮源性，确认分离得到的细胞为猪气管上皮细胞。

  3. 基因转染：以脂质体法将重组质粒pCI-neo-hTERT导入STECs。脂质体与质粒的体积比为1:3，转染48小时后加G418进行抗性筛选1个月，得到抗G418的阳性克隆，继续扩大培养。

  4. 基因表达检测：采用PCR和Western blot法检测转染后STECs中hTERT基因的表达情况。

  5. 细胞增殖活性检测：用MTT法和流式细胞仪分别检测转染细胞的活力和增殖周期。

实验结果

转染效率与基因表达

通过倒置显微镜观察，转染后的STECs形态正常，细胞呈单层贴壁，多边形铺路石状生长。PCR扩增得到大小为461 bp的hTERT基因片段，Western blot检测得到大小为125 ku的特异性条带，表明hTERT基因在转染细胞中成功表达。

细胞增殖特性

细胞活力曲线显示，转染后的STECs在接种后的第3～5天增殖速度快。流式细胞仪检测结果显示，转染细胞的细胞核型为2倍体，S期细胞比例达到48.35%，说明转染后的细胞具有较高的增殖活性。

永生化细胞系的建立

经过长期培养，转染hTERT基因的STECs成功建立了永生化的细胞系，可传代至55代以上，且保持了原代细胞的形态及功能特性。永生化细胞系具有正常的细胞增殖周期，比原代细胞生长更为活跃。

讨论

端粒酶与细胞永生化

端粒是影响细胞永生化机制的重要因素之一。端粒长度决定了细胞的增殖能力和寿命，足够长的端粒长度能在染色体末端形成环状结构，提供保护。当端粒缩短到一定程度时，细胞将逐渐失去增殖能力，导致衰老和死亡。通过激活端粒酶，可以延长染色体末端DNA，确保端粒足够的长度，从而延长细胞在体外培养的寿命。本研究通过转染hTERT基因，成功激活了STECs的端粒酶活性，实现了细胞的永生化。

永生化细胞系的应用前景

永生化细胞系具有长期培养、增殖活性高、遗传性状稳定等优点，是研究疾病发病机制、药物筛选和疫苗开发的重要工具。本研究建立的永生化的STECs不仅保持了原代细胞的形态及功能特性，还具有更高的端粒酶活性和增殖活性。该细胞系可用于猪呼吸道病原体的感染研究，为揭示猪呼吸道疾病的发病机制提供新的细胞模型。

实验策略与创新点

本研究采用脂质体法将重组质粒pCI-neo-hTERT导入STECs，通过优化转染条件，提高了转染效率。同时，通过严格的抗性筛选和纯化步骤，成功建立了永生化的细胞系。该细胞系的建立不仅为猪呼吸道疾病的研究提供了新的细胞模型，也为其他动物细胞永生化的研究提供了借鉴。

研究的创新与应用

创新点

  1. 方法创新：本研究采用脂质体法将hTERT基因转染至STECs，成功实现了细胞的永生化，为猪呼吸道上皮细胞的长期培养提供了新方法。

  2. 模型创新：建立的永生化的STECs保持了原代细胞的形态及功能特性，具有更高的增殖活性，为猪呼吸道病原体的感染研究提供了新的细胞模型。

应用前景

  1. 疾病研究：永生化的STECs可用于猪呼吸道病原体的感染研究，揭示病原体的致病机制和宿主的防御机制。

  2. 药物筛选：该细胞系可用于药物筛选，评估药物对猪呼吸道病原体的抑制作用和细胞毒性。

  3. 疫苗开发：永生化的STECs可作为疫苗开发的细胞基质，用于生产高效、安全的疫苗。