摘要：本研究旨在将细胞电通透技术应用于DNA肌肉转染，通过优化电场强度、脉冲时值和质粒剂量等参数，实现高效电转染。实验采用增强绿色荧光蛋白（EGFP）基因质粒作为基因，注射到小鼠胫前肌后给予特定电脉冲，转染率显著提高。该方法为基因治疗及体内基因表达研究提供了新思路和应用前景。

引言

绿色荧光蛋白（GFP）是一种来自水母的蛋白质，具有独特的荧光性质，能够在特定波长光的激发下发出绿色荧光。近年来，GFP被广泛应用于生物学研究中，特别是在转基因动物研究中得到了广泛认可。利用GFP基因的表达，科学家可以追踪细胞、组织以及整个生物体系的运动和功能。在转基因动物研究中，通过将GFP基因转入目标细胞或组织中，科学家可以用荧光显微镜观察其在生物中的位置和运动轨迹，繁殖情况以及基因表达水平等重要信息。

肌肉是非病毒载体基因转染的良好场所，可以长时间表达基因产物，且在体内容易被触及。通过骨骼肌转染治疗性基因，可用于治疗进行性肌营养不良等肌肉本身疾病，还可以用于表达血管生成因子治疗肢体缺血性疾病或合成疫苗等。然而，单纯肌肉注射裸基因或者含有基因的质粒其表达水平极低，不易获得具有显著性的有效结果。

1998年，Mir等首次提出了肌肉基因电转染的新方法，通过细胞电通透作用，可以简单而又有效地将非病毒载体基因转入动物肌肉，包括灵长类动物。肌肉基因电转染成为研究的热门领域，并有望将来被用于肿瘤、贫血等疾病的临床治疗。本研究旨在探讨肌肉基因电转染的条件，为后续利用肌肉进行抗肿瘤基因的电转染研究奠定基础。

材料与方法

1.1 质粒

pEGFP-C1绿色荧光蛋白质粒，由吉林大学前列腺疾病防治研究中心惠赠（以下称为EGFP质粒）。EGFP质粒置于大肠E.coli菌JM109内扩增，碱裂解法提取、纯化。琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒，其中超螺旋结构占70%～80%，无RNA残留。质粒溶解于K-PBS溶液（NaCl 30.8 mmol·L?1、KCl 20.7 mmol·L?1、Na?HPO? 8.1 mmol·L?1、KH?PO? 1.46 mmol·L?1、MgCl? 10 mmol·L?1溶解于双蒸水）中，定量，调节质粒浓度为1 g·L?1。

1.2 动物

昆明系小白鼠购于吉林大学实验动物中心，共160只，4～6周龄，体重18～20 g，雌雄各半，随机分组，每组8只。

1.3 电通透仪

电通透仪由方波电脉冲发生器和针式电极组成（自行研制）。方波电脉冲发生器输出电脉冲主要指标：电场强度0～2500 V·cm?1，脉冲时值0～100 ms，脉冲次数0～15次，脉冲频率0～10 Hz。针式电极为双针电极，正负极间距0～1 cm，为银制电极。

1.4 肌肉基因电转染参数的确定

浓度为1 g·L?1质粒根据实验需要量注射到小鼠的胫前肌，注射后给予电脉冲，针式电极间距0.6 cm、次数8次、频率1 Hz为固定参数。1周后处死动物，取小腿胫前肌冰冻切片后荧光显微镜下进行观察。

1.4.1 电场强度和脉冲时值的确定

EGFP质粒DNA 15 μg，注入30 s后给予电脉冲。按电场强度和脉冲时值共分为8组，即20和50 ms组分别给予电场强度0、100、200和400 V·cm?1。观察不同电场强度和脉冲时值对转染率的影响。其中，0 V·cm?1的20和50 ms组相当于单纯质粒肌肉注射实验。

1.4.2 注入质粒剂量的确定

电场强度200 V·cm?1、脉冲时值20 ms，注入30 s后给予电脉冲。按质粒DNA注入的量分为3组，即7.5、15和30 μg组。

1.4.3 注入质粒后给予电脉冲的时间间隔的确定

质粒DNA 15 μg，电场强度200 V·cm?1、脉冲时值20 ms。按注入后给予电脉冲的时间间隔分为2组，即注入质粒30 s后给予电脉冲（electric pulse, EP）组和注入质粒1 h后给予EP组。

1.4.4 转染后DNA表达时间的确定

质粒DNA 15 μg，电场强度200 V·cm?1、脉冲时值20 ms，注入30 s后给予电脉冲。按转染后处死动物进行观察的时间不同分为7组，即按处死动物的不同时间分为转染后第1、3、7、14、21、28和35 d组。

1.5 转染阳性肌纤维的确定

所取的骨骼肌标本先迅速置于液氮中冰冻，然后保存在-80℃冰箱中。取转染区骨骼肌做冰冻切片，厚度为100 μm，荧光显微镜下观察到阳性转染的肌纤维发出绿色荧光。发现阳性转染细胞后，切片厚度改为12 μm，荧光显微镜下观察结果，与光镜下对比后计数，按以下公式计算转染率。

结果

EGFP质粒15 μg注射到小鼠的胫前肌，在注入后给予如下参数，即电脉冲200 V·cm?1，20 ms，1 Hz，8次，转染率，可达（73.2±7.2）%。EGFP质粒注射后不会在细胞外立即降解，注射质粒DNA 1 h内给予电脉冲不影响转染率；15 μg为适当的DNA剂量；EGFP蛋白的表达，7 d达到高峰。

讨论

2.1 电转染法优化参数的确定

本研究通过一系列实验，确定了肌肉基因电转染的参数条件。实验结果表明，当EGFP质粒剂量为15 μg，电场强度为200 V·cm?1，脉冲时值为20 ms，脉冲频率为1 Hz，脉冲次数为8次时，转染率，可达（73.2±7.2）%。这一结果为后续实验提供了重要的参考依据。

2.2 电转染法提高转染率的机制

与单纯EGFP质粒肌肉注射相比，DNA肌肉电转染可极大地提高其转染率。这一结果可能与细胞电通透作用有关。细胞电通透是一种利用短暂的高压电脉冲改变细胞膜通透性的技术，可使细胞膜形成微小孔洞，允许外源DNA进入细胞内。本研究通过优化电脉冲参数，实现了高效、安全的DNA肌肉转染。

2.3 电转染法在基因治疗中的应用前景

肌肉是非病毒载体基因转染的良好场所，可以长时间表达基因产物，且在体内容易被触及。通过骨骼肌转染治疗性基因，可用于治疗进行性肌营养不良等肌肉本身疾病，还可以用于表达血管生成因子治疗肢体缺血性疾病或合成疫苗等。本研究为肌肉基因电转染提供了优化参数，为基因治疗及体内基因表达研究提供了新思路和应用前景。

2.4 研究的创新点

本研究创新性地将细胞电通透技术应用于DNA肌肉转染，并通过优化电场强度、脉冲时值和质粒剂量等参数，实现了高效电转染。此外，本研究还通过一系列实验验证了电转染法的安全性和可行性，为基因治疗及体内基因表达研究提供了新思路和应用前景。

结论

本研究将细胞电通透技术应用于DNA肌肉转染，通过优化电场强度、脉冲时值和质粒剂量等参数，实现了高效电转染。实验结果表明，当EGFP质粒剂量为15 μg，电场强度为200 V·cm?1，脉冲时值为20 ms，脉冲频率为1 Hz，脉冲次数为8次时，转染率，可达（73.2±7.2）%。与单纯EGFP质粒肌肉注射相比，DNA肌肉电转染可极大地提高其转染率。本研究为肌肉基因电转染提供了优化参数，为基因治疗及体内基因表达研究提供了新思路和应用前景。